Tip:
Highlight text to annotate it
X
Benvenuti al Novus serie protocollo di Visual.
In questo video potrete imparare a eseguire tutte le fasi di fluorescenza
immunocitochimica
utilizzando i metodi più comuni per questo test.
Prima di iniziare la procedura di ICC, si dimostrerà come preparare
vetrini e piastre di coltura cellulare seguita dalla placcatura delle nostre cellule.
Cominciamo da acido trattamento coprioggetto nuovi un molare di acido cloridrico per
24 ore.
Dopo decantazione off attentamente l'acido e rimuovere i vetrini,
laviamo ciascuno con acqua distillata,
poi un risciacquo finale con etanolo.
Come passaggio facoltativo è possibile posizionare i coprioggetti in un rack sottostrato
immergerlo
a 0,1 mg / soluzione di gelatina o polilisina
per cinque minuti.
Questi rivestimenti aiutante nel fornire ulteriore aderenza delle cellule al
coprioggetti
assicurare che non si staccano durante successive fasi di lavaggio.
Dopo il trattamento rimuovere il rack sottostrato e asciugare i vetrini nella cultura
cappuccio o un forno riscaldato.
Coprioggetti puliti asciutti vengono quindi inseriti in ciascun pozzetto di una ben sei
cultura piatto
e coperto con un coperchio.
Per risparmiare tempo, grandi quantità di piatti possono essere preparati in anticipo per un uso successivo.
Le piastre possono essere sterilizzati con il loro vincolo luce UV della cappa.
Con coprioggetti pulite preparate in sei pozzetti,
ora possiamo aggiungere le nostre cellule.
Platted qui in cellule aggiungere una densità di mezzo milione di cellule per pozzetto.
Le cellule vengono poi coltivate durante la notte in incubatrice o fino a che raggiungano la vostra preferita
densità.
Con le cellule piastrate il giorno precedente e durante la notte colta, siamo pronti
per avviare la procedura di ICC.
In questo primo giorno di ICC, fisseremo,
permeabilize,
cancellare e aggiungere un anticorpo primario per le cellule.
Inizia aspirando terreno di coltura da ciascun pozzetto seguita dalla fissazione del
cellule con formaldeide al 4% o 10% formalina
per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare fissativo e lavare ogni pozzetto due volte con PBS freddo ghiaccio.
Fare attenzione a non lasciare le pile a secco in questo
o qualsiasi ulteriore fase del protocollo.
Se l'epitopo della proteina di interesse è espressa intracellularmente,
permeabilizzazione cellulare è necessaria per l'anticorpo per accedere alla
cella.
Anche se vi sono molti differenti
agenti permeabilizzazione, i più comuni sono ,1-0,5%
concentrazione
di Tween-20
o Triton-X100
diluito in PBS.
Tween-20 è utilizzato per epitopi situati nel citoplasma
mentre Triton-X100 è utilizzato per permeabilizzante nucleo e mitocondri.
Incubare i pozzetti con tampone di permeabilizzazione per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare buffer di permeabilizzazione e lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con
PBS spago.
PBS spago contiene 0,1% di Tween-20.
Noi ora bloccare i siti di legame non specifici con un tampone di bloccaggio per 1 ora
a temperatura ambiente.
Il buffer migliore bloccaggio è PBST contenente 10% di siero dall'host
specie del vostro anticorpo secondario.
Tuttavia,
1% BSA in PBST possono anche essere utilizzati.
Preparare l'anticorpo primario diluendolo nel tampone di bloccaggio
alla diluizione raccomandata specificato dalla scheda.
Diverse diluizioni strette sono utili per tenere conto di variabili che possono essere
diversa la propria analisi
e per raggiungere i migliori risultati.
Incubare a 4 gradi Celsius durante la notte.
Nel nostro esempio,
dato che stiamo usando un primario non coniugato useremo un fluoroforo
secondario coniugato il secondo giorno.
Nel secondo giorno della nostra procedura ICC
noi aggiungeremo il nostro anticorpo secondario,
eseguire una doppia etichettatura facoltativa e passo etichettatura nucleare,
montare i nostri coprioggetti alle diapositive,
e ottenere immagini dei nostri anticorpi con un microscopio a fluorescenza.
Per prima cosa aspirare fuori primaria soluzione anticorpi dopo il lavaggio della cella
tre volte con PBST per cinque minuti ciascuno.
Preparare il successivo floraform anticorpo secondario coniugato che si lega al primario
anticorpo.
Diluire il buffer secondario di blocco
Segnala a un amico con la diluizione indicata nella scheda tecnica
temperatura ambiente e incubato per un'ora.
Coprire le piastre con un foglio impedisce coloranti sensibili da degradante.
Aspirare dalla soluzione anticorpo secondario seguito da lavaggio delle cellule
tre volte con PBST
per cinque minuti ciascuno.
Come passaggio facoltativo una seconda coppia primaria e secondaria può essere utilizzata
per visualizzare un secondo epitopo
utilizzando un piano diverso per esso.
Inoltre, coloranti legano al DNA, come DAPI
può essere applicato senza la necessità di anticorpi secondari.
Fare riferimento al protocollo completo Novus scritto per ulteriori istruzioni su come raddoppiare e
etichetta triple.
Coprioggetto sono ora pronti per essere montati su vetrini da microscopio.
Prendere un vetrino pulito e versare una goccia di mezzo di montaggio antifade lentamente
comporre lo stantuffo della pipetta.
Rimuovere con cautela un vetrino coprioggetti dal pozzo,
consentono di lavaggio in eccesso sgocciolare
e posizionare le celle a faccia in giù su un vetrino.
Unghia polacco trasparente può essere utilizzato per sigillare il coprioggetto ed evitare che
essiccazione.
I vetrini possono essere visualizzati con un microscopio
o conservati a -20 o 4 gradi Celsius
in una scatola scura o un libro scorrevole.
Limitare la quantità di tempo è esposto ogni diapositiva alla luce del microscopio sarà aiutante in
prolungare il segnale fluorescente
e impedirà foto sbiancamento.