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Benvenuti al Novus serie protocollo di Visual.
In questo video impareremo come eseguire tutte le fasi di un Western Blot utilizzando la
metodi più comuni per questo test.
Prima di poter iniziare a preparare la macchia si deve prima preparare il nostro campione lisato.
In questo esempio, prepareremo un lisato di proteine da cellule in coltura.
Qui si lavare le cellule due volte con PBS ghiacciato e tampone di lisi abbastanza
per coprire le cellule.
La scelta di tampone di lisi dipende in gran parte la localizzazione
della proteina di interesse.
Abbiamo raschiare le cellule e trasferire la soluzione cella in un tubo da centrifuga
posti su ghiaccio.
Al fine di solubilizzare le proteine di membrana legati, si passa attraverso un potenziamento
detergenti estrazione rispetto isolate proteine citoplasmatiche.
In questo esempio si utilizza un tampone standard RIPA, che è un comune buffer
per ottenere il massimo rendimento proteina. Durante l'estrazione delle proteine da tutti
localizzazioni cellulari,
è molto importante includere inibitori della proteasi nel tampone di lisi che sarà
prevenire il degrado del campione. Utilizzare sempre proteasi preparata
inibitori, mantenere i campioni su ghiaccio e lavorare velocemente.
Noi pidocchi le cellule pipettando su e giù per
seguito da incubazione in ghiaccio per 30 minuti.
Poi centrifugare le cellule in una pallina.
Eliminare il pellet e raccogliere il surnatante. Questa è la tua lisato.
Determinare la concentrazione di proteine totali del campione lisato
testare una piccola porzione del lisato con una proteina commercialmente disponibile
quantificazione del metodo, come il BCA.
Questo vi aiuterà a caricare la stessa quantità di proteine nel gel.
Western blot sono tradizionalmente preformati sotto ridotta e denaturato
condizioni.
Tali condizioni permetterebbero proteine di essere separati dal loro peso molecolare
piuttosto che la loro forma nativa conformazionale o carica.
Per ridurre e denaturare i campioni,
diluire ciascuna in un buffer di caricamento come quelli del tampone Laemmli tradizionale.
Questo buffer contiene beta-mercaptoetanolo, o DTT, per ridurre disolfuro
creste tra cisteine,
SDS per assistere denaturazione a fornire una proteina netta negativa,
glicerolo per consentire ai campioni di affondare in ciascun pozzetto,
blu bromofenolo per visualizzare il lisato
e un buffer iconico.
Votex ogni campione e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti
completamente denaturare le proteine. Ora siete pronti per caricare i campioni in un
SDS pagina gel.