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Dopo electrotransfer delle nostre proteine ad una membrana, noi ora bloccare l'
Blot,
applicare un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse e quindi un anticorpo secondario
che riconosce l'anticorpo primario.
Avviare rimuovendo la membrana dal cassetto e risciacquo tre volte
acqua.
Come passaggio facoltativo, siamo in grado di verificare le proteine sono state trasferite con successo
colorando la membrana con Ponceau rosso.
Incubare la membrana in ponceau per cinque minuti e lavare con acqua fino
le bande sono chiare.
Dopo la verifica del blot può essere de-stained continuando a lavare con
acqua o TBS spago finché il colorante viene completamente rimosso.
Abbiamo bisogno di bloccare tutte le aree della macchia che non contengono già proteine.
Ciò impedirà il legame non specifico dell'anticorpo e ridurre complessiva
sfondo del segnale.
Comuni tamponi di blocco includono 5% senza grassi del latte secco per il dosaggio
in una soluzione di TBS spago.
Tuttavia non usare il latte quando la rilevazione con anticorpi fosfo specifici in quanto si può
causare un elevato background dal suo fosfoproteina endogena, cesio.
Incubare la membrana con soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente
sotto agitazione leggera.
Decantare la soluzione di saturazione e lavare con TBS spago per cinque minuti.
Siamo ora pronti ad aggiungere il nostro anticorpo. Diluire l'anticorpo primario in un
tampone di bloccaggio alla concentrazione raccomandata nel foglio dati.
Incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata.
Un passo consigliato opzionale è usare anche un controllo positivo anticorpo caricato
che permette all'utente di verificare uguali quantità di proteine totali sono stati caricati in ciascuna
così e aiutanti nella risoluzione dei problemi, eliminando qualsiasi incertezza
la procedura di Western Blot. Il giorno successivo, decantare l'anticorpo primario e
lavare la membrana con grandi volumi di TBS spago e vigorosa agitazione
cinque volte per cinque minuti ciascuno.
Questi lavaggi stringenti sono estremamente importanti per la rimozione non specifico
sfondo segnali.
Dopo il lavaggio, diluire l'anticorpo secondario nella soluzione di blocco e
incubare la membrana per un'ora a temperatura ambiente alla concentrazione
raccomandato nel foglio dati.
Nel nostro esempio il secondario è coniugato a HRP per dopo
rilevamento.
Membrana Decantare e lavare secondaria con grandi volumi di TBS con spago
agitazione vigorosa cinque volte per cinque minuti ciascuno. Ora siete pronti per la
rilevazione di fase.