Tip:
Highlight text to annotate it
X
Con le cellule piastrate il giorno precedente e durante la notte colta, siamo pronti
per avviare la procedura di ICC.
In questo primo giorno di ICC, fisseremo,
permeabilize,
cancellare e aggiungere un anticorpo primario per le cellule.
Inizia aspirando terreno di coltura da ciascun pozzetto seguita dalla fissazione del
cellule con formaldeide al 4% o 10% formalina
per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare fissativo e lavare ogni pozzetto due volte con PBS freddo ghiaccio.
Fare attenzione a non lasciare le pile a secco in questo
o qualsiasi ulteriore fase del protocollo.
Se l'epitopo della proteina di interesse è espressa intracellularmente,
permeabilizzazione cellulare è necessaria per l'anticorpo per accedere alla
cella.
Anche se ci sono molti agenti permeabilizzazione differenti, i più comuni
sono ,1-,5% di concentrazione di Tween-20 o
Triton-X100
diluito in PBS.
Tween-20 è utilizzato per epitopi situati nel citoplasma
mentre Triton-X100 è utilizzato per permeabilizzante nucleo e mitocondri.
Incubare i pozzetti con tampone di permeabilizzazione per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare buffer di permeabilizzazione e lavare tre volte per 5 minuti
ciascuno con PBS spago.
PBS spago contiene 0,1% di Tween-20.
Noi ora bloccare i siti di legame non specifici con un tampone di bloccaggio per 1 ora
a temperatura ambiente.
Il buffer di blocco è migliore PBST contenente 10% siero dal
ospitare specie di tuo anticorpo secondario.
Tuttavia, 1% BSA in PBST possono anche essere utilizzati.
Preparare l'anticorpo primario diluendolo nel tampone di bloccaggio alla raccomandata
diluizione indicata sulla scheda.
Diverse diluizioni strette sono utili per tenere conto di variabili che
può essere diverso nel vostro saggio e
per ottenere i migliori risultati.
Incubare a 4 gradi Celsius durante la notte.
Nel nostro esempio, dal momento che si utilizza un primario non coniugato useremo un fluoroforo
secondario coniugato il secondo giorno.