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Nel secondo giorno della nostra procedura ICC noi aggiungeremo il nostro anticorpo secondario, eseguire
un'etichettatura facoltativa doppia e passo etichettatura nucleare,
montare i nostri coprioggetti alle diapositive, e ottenere immagini dei nostri anticorpi con
un microscopio a fluorescenza.
Prima
abbiamo aspirare off primario soluzione anticorpi seguente lavando le cellule
tre volte con PBST per cinque minuti ciascuno.
Preparare il successivo floraform anticorpo secondario coniugato che si lega
l'anticorpo primario.
Diluire il buffer secondario di blocco
alla diluizione recommend specificato nella scheda tecnica
ed incubare a temperatura ambiente per un'ora.
Coprire le piastre con un foglio impedisce coloranti sensibili da degradante.
Aspirare dalla soluzione anticorpo secondario seguito da lavaggio delle cellule
tre volte con PBST
per cinque minuti ciascuno.
Come passaggio facoltativo una coppia separata primario e secondario possono essere utilizzati
per visualizzare un secondo epitopo utilizzando un piano diverso per esso.
Inoltre, coloranti DNA leganti come DAPI può essere applicato senza la necessità di
anticorpi secondari.
Fare riferimento al protocollo completo Novus scritto per le istruzioni su come raddoppiare e
etichetta triple.
Coprioggetto sono ora pronti per essere montati su vetrini da microscopio.
Prendere un vetrino pulito e versare una goccia di mezzo di montaggio antifade lentamente
comporre lo stantuffo della pipetta.
Rimuovere con cautela un vetrino coprioggetti dal pozzo,
consentono di lavaggio in eccesso sgocciolare
e posizionare le celle a faccia in giù su un vetrino.
Unghia polacco trasparente può essere utilizzato per sigillare il coprioggetto ed evitare che
essiccazione.
Le diapositive possono ora essere visualizzati al microscopio o conservato a -20
o 4 gradi Celsius in una scatola scura o un libro scorrevole.
Limitare la quantità di tempo ogni diapositiva è esposto alla luce del microscopio volontà aiutante
nel prolungare il segnale fluorescente
e prevenire fotoindotto.