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Benvenuti al Novus serie protocollo di Visual.
In questo video impareremo come eseguire tutte le fasi di un Western Blot utilizzando la
metodi più comuni per questo test.
Before we can start preparing the blot we must first prepare our sample lysate.
In questo esempio, prepareremo un lisato di proteine da cellule in coltura.
Qui
laviamo le cellule due volte con PBS freddo ghiaccio
e tampone di lisi sufficiente a coprire le cellule.
La scelta di tampone di lisi dipende in gran parte
scelta della proteina di interesse.
Abbiamo raschiare le cellule e trasferire la soluzione cella in un tubo da centrifuga
posti su ghiaccio.
Al fine di solubilizzare le proteine di membrana legati, si passa attraverso un potenziamento
detergenti estrazione rispetto isolate proteine citoplasmatiche.
In questo esempio
stiamo utilizzando un tampone standard RIPA,
che è un buffer comune per ottenere il massimo rendimento proteina. Mentre l'estrazione
proteine da tutte le localizzazioni cellulari,
è molto importante includere inibitori della proteasi nel tampone di lisi che sarà
prevenire il degrado del campione. Utilizzare sempre proteasi preparata
inibitori, mantenere i campioni su ghiaccio e lavorare velocemente.
Noi pidocchi le cellule pipettando su e giù per
seguito da incubazione in ghiaccio per 30 minuti.
Poi centrifugare le cellule in una pallina.
Eliminare il pellet e raccogliere il surnatante. Questa è la tua lisato.
Determinare la concentrazione totale del lisato proteico
testare una piccola porzione del lisato
con un saggio proteico disponibile in commercio quantificazione
come il BCA.
Questo vi aiuterà a caricare la stessa quantità di proteine nel gel.
Western blot sono tradizionalmente preformati sotto ridotta e denaturato
condizioni. Tali condizioni permetterebbero proteine di essere separati dal loro
peso molecolare
piuttosto che la loro forma nativa conformazionale o carica.
Per ridurre e denaturare i campioni,
diluire ciascuna in un buffer di caricamento come quelli del tampone Laemmli tradizionale.
Questo buffer contiene beta-mercaptoetanolo, o DTT, per ridurre disolfuro
tra cisteine,
SDS per assistere denaturazione di una proteina netta negativa,
glicerolo per consentire ai campioni di affondare in ciascun pozzetto,
blu bromofenolo per visualizzare il lisato e un buffer iconico.
Votex ogni campione e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti
completamente denaturare le proteine. Ora siete pronti per caricare i campioni in un
in un gel SDS PAGE.
Per questo prossimo passo sarà separare le singole proteine nel nostro campione
lisato
in base al loro peso molecolare
utilizzando un elettrodo positivo di attirare una proteina caricata negativamente.
Per fare questo
Carichiamo i nostri campioni di proteine precedentemente preparati in un disponibile in commercio
gel di poliacrilammide.
I gel sono disponibili in percentuali fisse o sfumature di acrilamide.
Maggiore è l'acrilamide minore è la percentuale di gel
percentuale.
Pertanto gel percentuali più elevate sono migliori per le proteine di basso peso, bassa percentuale
I gel sono migliori per le proteine di peso grandi e gel gradiente possono essere utilizzati per
proteine di tutte le dimensioni
a causa della loro gamma variabile in dimensione dei pori.
Preparare il gel inserendolo dell'apparato elettroforesi e
riempimento con tampone di corsa che è appropriato per la chimica del vostro gel.
Sciacquare i pozzetti del gel con tampone di corsa e aggiungere al tampone
camere.
Caricare i campioni nei pozzetti.
Se non siete sicuri della quantità da caricare,
10-30 microgrammi di proteine totali è un punto di partenza suggerito
come pure l'intera quantità di campione caricato.
Sarà inoltre necessario prenotare almeno un bene per prestained peso molecolare
scala.
La scala vi permetterà di monitorare la separazione delle proteine durante la
elettroforesi e successivamente verifica il peso di proteine nel campione durante
analisi successive.
Chiudere l'unità di elettroforesi e collegarlo ad un alimentatore. La maggior parte delle unità
funzionano normalmente 45-60 minuti a 200 volt
o finché il buffer di caricamento raggiunge il fondo del gel.
Durante questo tempo le proteine caricate negativamente in ogni campione migrerà verso
l'elettrodo di carica positiva che si fanno strada attraverso il poliacrilammide
gel matrice.
In questa fase successiva, ci trasferiremo le nostre proteine separate su gel
e in una membrana solida o blot.
Questo si basa sul principio stesso del passaggio precedente
in cui un campo elettrico viene applicato per rimuovere le proteine negative
verso un elettrodo positivo.
Il trasferimento può avvenire in condizioni di bagnato o semi-secco.
Qui si dimostra il metodo tradizionale di trasferimento bagnato. Cominciare rimuovendo
il gel dalla cassetta
il taglio della porzione superiore contenente i pozzetti.
Tacca in alto a sinistra per l'orientamento gel indicato.
Float il gel in tampone di trasferimento durante la preparazione del panino di trasferimento.
Per rendere il sandwich trasferimento
avrete bisogno di una cassetta,
spugna, carta da filtro
il gel
e la vostra scelta di una membrana di PVDF o nitrocellulous.
PVDF deve essere attivato immergendo la membrana in etanolo per
due minuti. Ma a parte questo la scelta di PVDF o nitrocellulous
membrana è una preferenza personale.
Tacca in alto a sinistra per indicare l'orientamento macchia
e incubare membrane in tampone di trasferimento per 10 minuti.
Creare una pila inserendo i seguenti componenti
dal catodo negativo nero a rosso anodo positivo:
spugna,
carta da filtro,
membrana,
(Fare attenzione a non toccare il gel o la membrana con le mani e utilizzare
pinzette pulite o spatola al posto.
Toccare la membrana durante qualsiasi fase può contaminare il blot e provocare
sfondo segnale eccessivo. ),
carta da filtro
e spugna.
Utilizzare un rullo pulito, con ogni strato di rotolare delicatamente eventuali bolle che possono essere
presenti
poiché bolle inibiscono il trasferimento efficiente di proteine.
Bloccare la cassetta e metterlo nella apparecchi contenenti freddo
trasferimento del buffer
assicurando che la cassetta sia posizionata correttamente da negativo a positivo.
Al fine di evitare l'accumulo di calore, è utile per trasferire con un raffreddore
imballare nell'apparato
apparecchio o in una camera fredda con la barra ogiva posto al fondo della camera.
Chiudere la camera e collegare ad un alimentatore.
Effettuare il trasferimento secondo le istruzioni del produttore che è
normalmente 100 volt per 30-120 minuti.
Dopo electrotransfer delle nostre proteine a una membrana, ci sarà
ora bloccare la macchia,
applicare un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse e una secondaria
anticorpo che riconosce l'anticorpo primario.
Avviare rimuovendo la membrana dalla cassetta di risciacquo e tre volte in acqua.
Come passaggio facoltativo, siamo in grado di verificare le proteine sono state trasferite con successo
colorando la membrana con Ponceau rosso.
Incubare la membrana in ponceau per cinque minuti e lavare con acqua fino
le bande sono chiare.
Dopo la verifica
la macchia può essere de-colorate continuando a lavare con acqua
TBS o spago
fino a quando il colorante viene completamente rimosso.
Abbiamo bisogno di bloccare tutte le aree della macchia che non contengono proteine.
Ciò impedirà il legame non specifico dell'anticorpo e ridurre complessiva
sfondo del segnale.
Comuni tamponi di blocco includono 5% senza grassi del latte secco per il dosaggio
in una soluzione di TBS spago.
Tuttavia non usare il latte quando la rilevazione con anticorpi fosfo specifici
in quanto può causare un elevato background dal suo fosfoproteina endogena, cesio.
Incubare la membrana con soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente
temperatura
sotto agitazione leggera.
Decantare la soluzione di saturazione e lavare con TBS spago per cinque minuti.
Siamo ora pronti ad aggiungere il nostro anticorpo. Diluire l'anticorpo primario in un
tampone di bloccaggio alla concentrazione raccomandata nel foglio dati.
Incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata.
Un passo opzionale consigliato è quello di utilizzare anche un anticorpo di controllo positivo
che permette all'utente di verificare uguali quantità di proteine totali sono stati caricati in
ogni bene e aiutanti nella risoluzione, eliminando qualsiasi
incertezze con la procedura di Western Blot.
Il giorno successivo,
decantare l'anticorpo primario e lavare la membrana con grandi volumi
TBS di spago e vigorosa agitazione
cinque volte per cinque minuti ciascuno.
Questi lavaggi stringenti sono estremamente importanti per la rimozione non specifico
sfondo segnali.
Dopo il lavaggio, diluire l'anticorpo secondario nella soluzione di blocco e incubare
la membrana per un'ora a temperatura ambiente alla concentrazione
raccomandato nel foglio dati.
Nel nostro esempio il secondario è coniugato a HRP per dopo
rilevamento.
Membrana Decantare e lavare secondaria con grandi volumi di TBS con spago
agitazione vigorosa cinque volte per cinque minuti ciascuno.
Ora siete pronti per la fase di rilevazione.
In questa fase finale, viene illustrato lo sviluppo segnale con il più comune,
metodo di rilevazione più sensibile e più economico il elettrochemiluminescenza
(O ECL) reazione.
Questo metodo utilizza l'enzima HRP,
che è stato coniugato al secondario per catalizzare la reazione e produrre ECL
luce.
Una luce viene poi raccolto su pellicola di raggi X e sviluppato
o digitalizzati con l'ausilio di una macchina fotografica specializzata abbastanza sensibile
per questa applicazione.
Iniziamo mescolando parti uguali reagenti ECL in un uno-a-un rapporto
secondo le istruzioni del produttore.
Noi incubare la membrana per 3-5 minuti senza agitazione.
Dopo l'incubazione, la miscela decantare ECL e utilizzare un laboratorio di pulire per togliere l'eccesso
soluzione dall'angolo della membrana.
Posizionare la membrana in un involucro di plastica trasparente, ad esempio un foglio di protezione per impedire
essiccazione. Evitare di lasciare la membrana completamente asciugare.
Ora possiamo usare un rullo per far uscire eventuali bolle o di qualsiasi soluzione in eccesso.
Immediatamente sviluppare la membrana.
Entrambi i sistemi di film e fotocamera consentono di regolare manualmente il tempo di esposizione
al fine di garantire una perfetta Western Blot immagine.
Densità relativa banda può essere quantificata con commercialmente disponibile
software.
. Adeguato peso molecolare può anche essere verificato confrontando dimensioni delle bande al
ladder peso molecolare.